1852年12月,利文斯通离开库汝曼,1853年5月抵达利尼扬蒂(Linyanti)。1853年11月11日利文斯通在当地人的陪伴下往西北探险,探险的路途困难重重,途中不但有强大好战的部落,还有疟疾、痢疾、昏睡病等致命疾病肆虐,探险队最后终于在高烧、半饥饿、痢疾的情况下于1854年5月31日抵达葡属西非的首都罗安达(São Paulo de Loanda)。1854年9月24日他又随探险队东行,在沿尚比西河下游的过程中发现维多利亚瀑布,1856年5月20日抵达葡属东非的克利马内(Quelimane)。利文斯通以一年八个月时间横跨整个大陆、从大西洋到印度洋,在当时是一项空前纪录。1856年12月9日,在阔别16年后,利文斯通终于回到英国,并且受到英雄式欢迎。在利文斯通踏上非洲前,欧洲人对于从喀拉哈里到撒哈拉之间的非洲地图几乎是一片空白,利文斯通的探险打开了“黑暗大陆”、带来丰富而准确的资料。
《Missionary Travels and Researches in South Africa》 (1857),扉页上的昆虫便是采采蝇。
1857年利文斯通将他的经历出版成书《Missionary Travels and Researches in South Africa》,这本书一出版便造成轰动,并翻译成为多种语言,启发许多欧洲人对非洲的兴趣。利文斯通认为他对地理探险比传教有更大的使命感,因此他在1857年退出伦敦会。1858年2月,在皇家地理学会的推荐下,利文斯通被任命为英国驻东非克利马内领事。
远征赞比西河
在英国政府的资助下,1858年3月10日利文斯通从利物浦搭乘HMS Pearl出发,开始尚比西河远征,5月14日抵达尚比西河河口。探险队成员包括医生John Kirk与利文斯通的弟弟Charles,他们搭乘蒸汽船Ma-Robert进入,9月8日抵达太特(Tete),并进入支流希雷河(Shiré),1859年9月16日发现尼亚萨湖(Nyassa)。利文斯通记述尼亚萨湖周边地区不像非洲其它部落,这里人口与农耕密集、种植多种作物,几乎每个村子都有自己的精炼场、木炭烧制跟铁工厂,他们的斧、矛、箭头、针、手镯、踝环等虽然不是出自最好的工艺,不过显然也要相当技术;这里也制造多种陶器和瓦器,颇有成为高度文明社会的潜力。1862年1月探险队回到尚比西河河口,在这里利文斯通与夫人会合,然而利文斯通夫人在4月27日由于疟疾病逝,对利文斯通造成重大打击。利文斯通对于奴隶贸易的干涉触怒了葡萄牙当局。1863年利文斯通接到Earl Russell的信要终止探险。1864年4月利文斯通抵达桑给巴尔(Zanzibar),7月23日回到英国。尚比西河远征跟利文斯通的其它探险比较起来没有什么重大发现,经常被当时的报纸视为一次失败,造成利文斯通此后募得探险经费的困难。利文斯通将这次探险经历收录于《Narrative of an Expedition to the Zambesi and its Tributaries》,于1865年出版。
1873年5月4日的早晨,在赞比亚班韦乌卢湖的南岸,人们发现利文斯通跪着祷告时过世了。他死于痢疾所造成的内出血和疟疾。利文斯通的仆人认为他们的主人的心应该永远留在非洲,他们将利文斯通的心脏挖出埋在附近的一棵树下,用能力所及最好的方法保存遗体,然后二位忠心的仆人朱玛和苏西(Chuma & Susi)跋涉千里将他的遗体运出,经过九个月终至桑给巴尔;最后送返英国,1874年4月18日利文斯通的遗体葬于伦敦西敏寺。在维多利亚瀑布旁的纪念像下写着:“基督教、通商、文明”(Christianity, Commerce and Civilization)。他最后七年的日志被整理在《The Last Journals of David Livingstone in Central Africa》,于1874年出版。